定量PCR Taqman探针的应用[高级篇]

　　Taqman探针虽然只发展了短短的几十年，但是无论在技术上还是在应用上都有了长足的发展，尤其是配合着细胞生物学，病理学等方面的发展，应用领域有了很大的延伸。

　　Taqman定量应用可以分为几个层次，第一个层次自然就是应用到临床检测，微生物检测和食品检测等方面，第二个层次是分子生物学层面的，包括对各种基因的表达进行定量或者半定量的分析(同一基因在不同组织中的表达差异，同一基因在不同药物处理后的表达差异，转基因食品的检测等)，第三个层次是包括突变分析，等位基因分析，DNA甲基化检测等在内的遗传学检测和单核苷酸多态性分析。

　　第一个层次：实际检测应用

　　这个层面主要是一些微生物检测，食品检测，环境监测以及一些医学临床应用(病源体检测，基因病诊断，传染病检测，微小残留病变检测等)，在这些方面定量PCR与传统的方法具有相似的灵敏度，但是耗时少，需要的劳动力也少，而且它们既可以从活着的也可以从死的病原菌中检测和定量核酸，而传统的微生物方法只能检测活的病原菌。

　　这些主要应用到的就是定量PCR在核酸浓度上的简单定量，由于之前要想在分子操作过程中知道核酸的浓度，主要应用的方法是琼脂糖凝胶电泳和，但是这两种方法前者靠主观判断，造成的偏差较大;后者很易受样品中杂质的影响。因此定量PCR由于其灵敏度高、特异性强、无污染性和准确性等特点当然成为了首选。

　　第二个层次：分子生物学应用

　　检测应用和分子生物学应用都是利用了定量PCR对基因表达的检测，只不过前者是在临床实际应用上，而后者则是侧重于科学研究。在分子生物学上定量PCR的应用相当广泛，包括基因转录检测(即同一基因在不同组织中的表达差异)，转基因生物检测，肿瘤耐药基因表达等在内的高通量基因表达检测(虽然Taqman相对于SYBR Green荧光染料，没有那么灵活，但是在陆续各生物技术公司推出一些相应试剂盒，也保证了Taqman在高通量方面的应用)。之前的高通量筛选基因表达差异的技术是cDNA 芯片和差异显示，但这两种技术的缺点是只能定性而非完整意义上的定量分析。定量PCR 技术的出现无疑为这种检测提供了极大的方便，利用定量 PCR检测产物并进行熔解曲线分析的方法，已经对cDNA 芯片和差异显示技术的结果进行了确认，而且得到了更加完整和精确的结果。

　　第三个层次：遗传学，SNP分析以及深入应用

　　点突变分析和等位基因分析：用不同的荧光报告基团标记的 Taqman探针分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个杂合子。实时定量PCR 的数据被标在xy坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对 96个样本进行基因分型。这一方法最先由Sevall在文章“Rapid allelic discrimination fromreal-time DNA amplification”中提及。

　　为了检测突变体，可以设计两种不同颜色的探针：一个探针设计来检测野生型，可以标记FAM，另一个标记JOE的探针来检测突变体。通常两个探针的差别只有1个bp，由于两个探针相差极小，因此一般推荐使用严格的反应条件。通过分析数据，两个通道的结果会呈现在一个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针(两个突变体)可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在图下方的表格中显示出来。

　　DNA甲基化分析：CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5’-甲基胞嘧啶被认为和许多人类疾病特别是癌症有关。Laird等人利用一种被称作 Methylight 的技术。 Methylight 是一种基于 Taqman 探针的甲基化特异定量 PCR技术。在扩增之前先处理DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它实时 PCR 方法一样，Methylight无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的DNA检测中被证明。

　　低密度表达谱分析：这一方面主要是配合ABI的系列产品：TaqMan® Low DensityArrays。这个芯片是从人，小鼠和大鼠的基因中挑选的4万个arrays，可以根据用户要求在反应板中固化不同基因的检测探针和引物，同时检测1个标本的384个不同的基因或8个标本的48个不同的基因，而且这个试剂盒是pre-loaded，方便使用，同其反应体积小(2ul)，节省试剂的优点一起构成了这个适用于标准化，中高通量基因表达研究的试剂。

　　SNP分析：SNPs，即单核苷酸多态性，这种人类最常见的可遗传变异占据了所有已知多态性的90%以上，因此作为研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，也因此国际人类基因研究学会花费大量的资金来完成人类单体型图谱。SNP分析从根本上来说其实就是确定一对染色体的每种基因的两个拷贝，哪种点突变在这两个拷贝中存在，因此利用定量PCR方法，并配合芯片技术可以快速灵敏的检测到SNP结果。ABI号称有数以千记的定量PCR试剂盒，自然在这方面也不会留下空白，TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百万的HapMap SNPs(人类单核苷酸多态性图谱SNPs)，方便SNP分型高通量研究。

　　细胞因子分析：细胞因子是一种由细胞分泌、能调节自身和其他细胞功能的小分子可溶性蛋白质或多肽。这种调节蛋白主要通过调节免疫反应而在免疫系统中起着核心作用。因此在许多免疫致病途径，对细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。由于受检样本中细胞因子含量往往往往都比较低下，因此定量PCR以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。

　　MicroRNA分析：miRNA这种小分子从2003年一直“火”到了如今，其魅力不可小窥，传统的检测和定量miRNA的方法是northern杂交,芯片技术以及核糖核酸酶保护分析(ribonuclease protectionassays)，这些方法都需要标记探针并与纯化的RNA进行杂交。但是由于成熟的活性miRNA及其前体有一段相同的靶序列，而基于杂交的各种技术又无法通过分子大小将它们区分，因此很难专一性的识别成熟miRNA，结果导致很高的前体背景信号，而且这些技术需要标记步骤或放射性同位素，费时，费钱还不讨好。利用Taqman技术可以发挥定量PCR的优点来解决这些问题，但是要定量miRNA又一个最大的难题：即小RNA分子太短(-22nt)，无法按常规设计随机引物进行反转录和实时PCR。ABI提供了一种试剂盒：TaqMan® MicroRNAAssays，设计特异性的茎环状反转录引物，这样有两个好处：专一性的与成熟miRNA结合;形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增子，为进一步做实时定量PCR提供了符合要求的摸板。