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摘 要： 选用固定液为FFAP的石英玻璃毛细管柱，设置合适的载气柱前压、分流比及程序升温，采用气相色谱法测定了采自云贵高原雪山、雪线附近土壤中的真菌的脂肪酸组成。测定结果表明，此方法能准确分离出真菌中的30多种组分，并鉴定出了主要的8种脂肪酸，筛选出能产生二十碳五烯酸（EPA）的四种真菌。平行测定的相对标准偏差为067%-420%，而且EPA的出峰时间仅为5905 min，只需10 min即可完成一次分析。 关键词：气相色谱法；真菌；二十碳五烯酸（EPA） 中图分类号：O65771；O623617；Q936 文献标识码：A 0 引 言 近二十年生物化学、药理学、营养学的研究表明：ω-3多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）具有降低血脂，预防心血管疾病发生和促进大脑发育等特殊生理功效［1-3］。海洋性生物如海洋鱼类、海洋性藻类的油脂中含有丰富的EPA和DHA；另外，一些微生物在其代谢过程中也会产生EPA和DHA。据文献［4-6］报道，产特种油脂的微生物主要有三类，即真菌、藻类和细菌等。真菌作为EPA和DHA的新来源，有无污染、生产周期短、成本低等优点，极有开发潜力。目前国内才开始对此进行研究，还未达到工业化生产阶段。为了监控真菌的发酵过程和筛选能产生EPA或DHA的具有商业价值的菌株，必须有效、准确地测定真菌的脂肪酸组成。 油脂中的脂肪酸组分一般采用气相色谱法进行分离和测定［7］。目前对植物油、鱼油、海洋生物的脂肪酸测定已有许多相关文献［8-11］，而对真菌脂肪酸组成测定的报道则较为鲜见，而且也没有规范、统一的检测方法。本文在参阅文献［8-11］的基础上，经过多次方法试验，建立了测定真菌脂肪酸组成的气相色谱方法。对采自云贵高原雪山、雪线附近土壤中并经贵州大学虫生真菌实验室发酵培养的多种真菌进行了脂肪酸组成的分析测定。测定结果表明，此方法能准确有效的应用于真菌脂肪酸组成的分析研究，并鉴定出了8种主要脂肪酸，筛选出能产生EPA的四种真菌。平行测定的相对偏差表明方法有较好的精密度和重复性。而且方法简便、快捷。 1 实验原理 因为油脂中的脂肪酸一般是以甘油酯形式存在，沸点较高，所以可利用快速酯交换先将油脂中的脂肪酸甲酯化后再进行气相色谱测定［7］。不同的油脂有不同的脂肪酸组成，其区别主要是在脂肪酸的碳链上含碳、不饱和键数康牟钜欤???嗌?卓衫?蒙?字???舅峒柞ニ孀盘荚?邮?脑黾樱?虿槐ズ图?氖?慷嗌倮唇?蟹掷牒筒舛ā?br> 2 实验部分 2.1 实验材料及试剂 真菌：贵州农学院虫生真菌实验室提供。 试剂：0.5 mol/l NaOH-CH3OH溶液；1∶1苯—石油醚混合溶液（试剂均为分析纯）；脂肪酸甲酯标准品（Sigma公司）。 2.2 仪器及测试条件 HP6890气相色谱仪，氢火焰检测器； 固定液为FFAP的石英玻璃毛细管柱，柱长25 m，柱径032 mm； 载气H2：81 kPa；分流比100∶1；燃气H2：30 ml/min；Air：400 ml/min； 进样口：250℃；检测器：250℃； 程序升温：190℃(1 min)—230℃(4 min)，每分钟升6℃。 2.3 真菌脂肪酸的快速甲酯化 将真菌真空干燥后，取300 mg左右，研碎后放入10 ml具塞试管中，加入1∶1苯-石油醚2 ml，浸提15 min后，再加入0.5 mol/lNaOH-CH3OH溶液2 ml，振摇后置于50℃水浴约15 min，取出后沿管壁加入蒸馏水使有机层上升至试管上部，静置分层后，取上层清液2μl作气相色谱分析。 3 结果与讨论 3.1 定性及定量分析 实验采用脂肪酸甲酯标准物作保留时间对照和峰高增量法定性。由于各脂肪酸为同系物，可以视相对校正因子为1，采取面积归一化法可测定脂肪酸组成。 3.4 方法的选择及优点 1.色谱柱的选择：考虑到脂肪酸酯类的极性，根据相似相溶原理，选用交联型固定液FFAP，它不仅适于分离脂肪酸酯类，而且热稳定性较好，高温不易氧化和流失；即便在高温操作，基线也只有很小的漂移。由于真菌的脂肪酸组成复杂，如用填充柱色谱，由于其柱效低，不能良好地分离各组分。而毛细管柱的柱径小，柱较长，因此柱效高，能使脂肪酸组分在柱内进行反复分配，并得以完全分离。因此选用毛细管气相色谱法测定。 2.载气柱前压的设置：载气压力设置过低，会使谱峰的半峰宽增加，或出现拖尾峰，分析时间也较长；载气压力过高，又会使相邻的峰不能完全分离，甚至出现谱峰重合现象。这些情况都会影响定性定量的准确性。经过多次实验，结果表明，当设置载气柱前压为81 kPa时，与柱前压为50 kPa时相比，出峰时间提前了近一倍，并且不影响出峰数目及分离效果，能准确地分离出30多种组分。 3.程序升温的设置：由于真菌的脂肪酸组成很复杂，如果采用恒温分析，谱峰无法得到良好的分离，所以需要设置程序升温，使各个组分按沸点高低依次出峰。多次实验表明，程序升温190℃(1 min)—230℃(4 min)，每分钟升6℃ ，在此条件下，能分离出30多个组分，并且EPA出峰时间还不到6 min，只需要10 min即可完成一次分析。 4 总 结 由测定结果可看出，本方法能准确地分离和测定真菌中的主要脂肪酸，有较好的精密度和较高的可靠性，EPA出峰时间仅为5.905 min，只需10 min即可完成一次分析。从气相色谱图也可看出，谱峰分离效果好，能分辨出真菌中的约30种脂肪酸。因此本文为真菌脂肪酸组成的测定和具有商业价值菌株的筛选提供了一个较为可行的分析方法。筛选出的真菌虽然EPA含量较少，但有望通过优化发酵条件以提高EPA的产率并通过生物工程培养出含EPA和DHA更多的具有商业价值的菌株。另外，本实验采用脂肪酸甲酯标准物对照定性，已鉴别出了8种主要的脂肪酸，而其他的组分还需结合GC-MS来定性研究。 致谢： 本文实验方法的建立得到了贵州师范大学理化实验中心张明时高级实验师的热情帮助和指导，在此特别表示衷心的感谢。同时也感谢中科院地化所环境室的邹申清同志对本实验研究所提供的帮助。 参考文献： ［1］ 余文三，等多不饱和脂肪酸的研究概况［J］国外医学：卫生学分册，1998，11（4）：61. ［2］ 何君健，等鱼油有益人体健康［J］粮油食品科技，1993，18（5）：23. ［3］ Bruerner G et al Biological effect of Poly- unsaturated Fatty acid［J］Food sci Technol，1992，53：631. ［4］ 张羽航，林炜铁，鲍时翔，等微生物发酵生产多不饱和脂肪酸的研究进展［J］中国油脂，1998，23(1)：42-45. ［5］ 徐华顺，罗玉萍，等微生物发酵产油脂的研究进展［J］中国油脂，1999，24(3)：46-49. ［6］ 徐天守利用生物技术生产二十碳五烯酸和二十碳六烯酸［J］食品与发酵工业，1995(1) ：56-63. ［7］ 陈文麟油脂化学［M］武汉：武汉粮食工业学院，1993，162-163. ［8］ 夏必坤气相色谱法测定食用植物油的脂肪酸组成及应用［A］中国化学会色谱专业委员会，等第十二次全国色谱学术报告会文集（下）［C］杭州:中国化学会，等1999，646-647. ［9］ 郑永杰，等气相色谱法测定马齿苋中的EPA和DHA［A］中国化学会色谱专业委员会，等第十一次全国色谱学术报告会文集（中）［C］大连:中国化学会,等，1997，403-404. ［10］ 蔡心尧，尹建军，鱼油脂肪酸组成的分析研究［A］中国化学会色谱专业委员会，等第十一次全国色谱学术报告会文集（中）［C］大连:中国化学会，等，1997，342-344. ［11］ 卫煜英，曹艳平市售四种食用贝类脂肪酸的提取和分析［A］中国化学会色谱专业委员会，等第十一次全国色谱学术报告会文集（下）［C］大连:中国化学会，等，1997，611-612. ［12］ 吉林化学工业公司研究院气相色谱实用手册［M］北京：化学工业出版社，1980，446. 本文出自http://www.gzit.edu.cn/ 本文转摘时未向原作者及杂志申请，如有版权问题请立即与中国分析仪器网联系！ |
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